Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов



На правах рукописи


УДК 548.5:532.5


БЕЗБАХ Илья Жанович


ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССОВ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БИОМАТЕРИАЛОВ


Специальность 01.04.07 – Физика конденсированного состояния


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук


Москва – 2007

Работа выполнена в муниципальном образовательном учреждении высшего проф образования "Столичный муниципальный технический институт Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов им. Н.Э. Баумана" и в Научно-исследовательском центре "Галлактическое материаловедение" Института кристаллографии им. А.В. Шубникова Русской академии


Научный доктор физико-математических наук

управляющий: ^ Стрелов Владимир Иванович


Официальные доктор технических наук, доктор

оппоненты: Андреев Владимир Викторович

кандидат физико Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов-математических наук

^ Плотников Федор Алексеевич


Ведущая организация: Филиал ФГУП "Научно-исследовательский
физико-химический институт им. Л.Я. Карпова"


Защита состоится « 31 » октября 2007 г. в 16:00 часов на заседании
диссертационного совета Д 212.141.17 при ГОУ Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов ВПО "Столичный
муниципальный технический институт им. Н.Э. Баумана" по адресу: 248600, г. Калуга, ул. Баженова, д. 2, МГТУ им. Н.Э. Баумана, Калужский филиал.


Ваши отзывы в 2-ух экземплярах, заверенные печатью,
просьба высылать по обозначенному Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов адресу.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
ГОУ ВПО МГТУ им. Н.Э. Баумана, Калужский филиал
(г. Калуга, ул. Баженова, д. 2)


Автореферат разослан « 27 » сентября 2007 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета

к
анд. техн. наук Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, доцент Лоскутов С.А.
^ ОБЩАЯ Черта РАБОТЫ

Актуальность работы. Кристаллизация биоматериалов в текущее время употребляется для ублажения возрастающей потребности структурной биологии для определения кристаллографических характеристик органических молекул, что в предстоящем позволяет проводить Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов как синтез новых веществ с требуемыми качествами, так и решать некие фундаментальные вопросы функционирования живых систем в целом. Важным фактором, ограничивающим эти исследования, являются процессы роста биокристаллов, оптимизация критерий которых в текущее Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов время проводится, в главном, эмпирическими способами.

В связи с этим, исследование закономерностей роста биокристаллов и разработка новых способов их получения являются животрепещущей научной задачей, что подтверждается и ростом числа публикаций в этой области исследовательских работ Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов.

Кристаллы белков выращиваются из смесей методом доведения раствора до определенных значений пересыщения. Пересыщение определяется как отношение текущей концентрации белка к его растворимости . В общем случае пересыщение может достигаться методом конфигурации Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов концентрации осадителя, белка и нейтральных добавок, pH, температуры и других характеристик.

Как и в случае неорганических соединений, при достижении пересыщения система, содержащая белок, движется к состоянию равновесия, при котором вещество распределяется меж веществом Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов и жесткой фазой.

Рост кристаллов белков можно поделить на три существенных шага: зародышеобразование, рост, достижение равновесия и прекращение роста. Кристаллы белков зарождаются при высочайшем уровне пересыщения, от 3 до 10, вырастают же при Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов , а при происходит растворение жесткой фазы. Кристаллы белков вырастают очень медлительно – их скорость роста на 2–3 порядка меньше, чем у неорганических кристаллов.

В текущее время для получения биокристаллов употребляются такие способы, как большая кристаллизация, микродиализ Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, свободная диффузия через поверхность раздела белка и осадителя, способ диффузии паров. Одним из принципиальных причин, объединяющих эти процессы, является тепломассоперенос (ТМП), определяющий качество получаемых кристаллов. Исследование особенностей и оптимизация процессов Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов ТМП при кристаллизации белковых молекул позволяет найти лимитирующие условия процессов получения совершенных кристаллов, создать способы управления процессом кристаллизации. В связи с этим, целью работы являлась оптимизация процесса выкармливания в земных и галлактических критериях высокосовершенных Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов кристаллов белков размером более 100 мкм на базе математического моделирования и экспериментального исследования процессов ТМП в растворе белка, также разработка способа и аппаратуры для температурного управления ростом кристаллов на примере модельного Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов белка лизоцима.


^ Объекты и способы исследования. Объектом исследовательских работ были выбраны кристаллы белка (фермента) лизоцима – обширно известного представителя биоматериалов, структура и характеристики которого довольно изучены, что позволяло проводить сравнительный анализ результатов Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов разработанного способа кристаллизации. В качестве способов исследования использовались математическое моделирование и экспериментальные исследования особенностей кристаллизации биоматериалов (в т.ч. для определения граничных критерий), разработка экспериментальной аппаратуры для получения высокосовершенных кристаллов белков, также способы рентгеноструктурного Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов анализа для исследования совершенства структуры приобретенных кристаллов.


^ Задачки исследования:

1. Найти главные причины, действующие на процесс кристаллизации белков.

2. Установить закономерности процессов кристаллизации биоматериалов на примере кристаллизации белка лизоцима для земных и галлактических критерий, зависимо Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов от интенсивности конвективных течений (в т.ч. конвекции Марангони) и наружных энергетических воздействий на раствор белка. Найти условия доминирования диффузионного ТМП.

3. Найти рациональные условия и создать способ выкармливания высокосовершенных кристаллов белков Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, применимых для рентгеноструктурного анализа (размером более 100 мкм).

4. Создать методику и метод (программку) управления процессом зародышеобразования и роста биокристаллов.


^ Научная новизна. В процессе выполнения диссертационной работы в первый раз получены последующие результаты Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов:

1. Установлены закономерности роста кристаллов биоматериалов при задании и прецизионном управлении температурой всего раствора белка и в локальной точке капилляра для обеспечения образования единичных центров кристаллизации.

2. Разработана математическая модель управления процессом кристаллизации, позволяющая найти зависимость Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов количества и размеров образующихся кристаллов от величины пересыщения в растворе, величины критичного пересыщения раствора и скорости кристаллизации.

3. Разработан метод и уникальная методика управления температурой как всего объема раствора белка Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, так и в локальной точке при кристаллизации биоматериалов.

4. На базе теоретических расчетов процессов ТМП в смесях белков разработан способ и экспериментальная установка для получения высокосовершенных кристаллов биоматериалов, в какой осуществляется не только Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов лишь управление температурой с точностью регулирования не ужаснее ±0,1°C, да и реализована возможность сотворения пересыщения раствора в заданном месте капилляра за счет точечного подвода либо отвода тепла (т.е. путем сотворения локального Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов градиента температуры).

^ Практическая значимость работы состоит в разработке способа управляемой кристаллизации биоматериалов, обеспечивающего раздельное управление процессом как на шаге зародышеобразования, так и в процессе роста образовавшихся кристаллов. Этот метод температурного управления процессом кристаллизации Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов биоматериалов является технологичным и действенным для выкармливания высокосовершенных кристаллов, при всем этом конвекция в растворе фактически исключается, а воздействие вибраций на процесс кристаллизации минимизируется и, таким макаром, обеспечиваются в большей степени диффузионные Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов условия массопереноса белка, т.е. условия стабильности для самоорганизации молекул белка и встраивания их в кристалл.


^ На защиту выносятся:

1. Результаты математического моделирования процесса обоюдной диффузии молекул белка и осадителя для реальных критерий кристаллизации модельного Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов белка лизоцима.

2. Результаты исследования воздействия диффузионных и конвективных процессов на кристаллизацию белков в земных и галлактических критериях с учетом термогравитационной и термокапиллярной (Марангони) конвекции.

3. Математическая модель процессов ТМП в растворе белка Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов для управления процессом кристаллизации при разработке в растворе локального градиента температуры.

4. Разработанный способ выкармливания высокосовершенных кристаллов белков в градиенте температуры в ячейках капиллярного типа.


^ Апробация работы. Главные результаты, выставленные в диссертации Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, были доложены и оговорены на последующих конференциях:

1. Всероссийская научно-техническая конференция "Прогрессивные технологии, конструкции и системы в приборо- и машиностроении " (Калуга, 2004 г.).

2. ХIV Интернациональная конференция по росту кристаллов "Fourteenth International Conference on Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов Crystal Growth" (ICCG-14) (Гренобль, Франция, 2004 г.)

3. VI Интернациональная конференция "Рост монокристаллов и тепломассоперенос" (ICSC-2005) (Обнинск, 2005 г.).

4. ХI и ХII Национальные конференции по росту кристаллов (Москва, 2004, 2006 гг.).

5. Русский симпозиум "Галлактическое материаловедение" (КМ Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов-2007) (Калуга, 2007 г.).

Результаты работы применены в НИЦ "Галлактическое материаловедение" ИК РАН (г. Калуга) для экспериментальной кристаллизации модельного белка лизоцима с высочайшим совершенством структуры при прецизионном управлении градиентом температуры в ячейках капиллярного типа.


Публикации. По теме Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов диссертации размещено 12 печатных работ.

^ Объем работы. Диссертационная работа включает 6 глав, выводы, перечень литературы и три приложения. Она изложена на 126 страничках текста, содержит 23 рисунка, 2 таблицы, 71 библиографических заглавий.


Благодарности. Создатель выражает искреннюю благодарность Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов медику технических наук, доктору В.Г. Косушкину (КФ МГТУ им. Н.Э. Баумана, г. Калуга) за бесценную поддержку при подготовке диссертации, ценные советы и замечания; также благодарит коллектив Лаборатории белковой Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов кристаллографии и лично И.П. Куранову (ИК РАН, г. Москва) за предоставление кристаллизационных смесей и проведение рентгеноструктурных исследовательских работ.


^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во внедрении обосновывается актуальность задачки, указываются главные цели исследования и положения, выдвигаемые Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов на защиту.

1-ая глава посвящена анализу литературных данных по теме работы. В ней иллюстрируются особенности структуры биоматериалов, указывается неувязка трудности кристаллизации, приводится обзор используемых способов выкармливания биокристаллов в наземных и галлактических критериях. На примере исследования Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов особенностей оборудования, применявшегося для выкармливания биокристаллов в космосе, иллюстрируется низкая стабильность термических критерий и невозможность динамического управления процессом кристаллизации в большинстве из описываемой кристаллизационной аппаратуры. Анализируются имеющиеся способы математического Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов моделирования процессов роста биокристаллов, указываются особенности разных подходов к моделированию: моделирование диффузионного массопереноса в кристаллизационных смесях и средах с поверхностью раздела газ-жидкость, моделирование диффузионно-конвективного тепломассопереноса, моделирование зародышеобразования, моделирование кинетики роста биокристаллов, моделирование Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов температурно-зависимых процессов кристаллизации биоматериалов. Обращается внимание на отсутствие принятой модели, описывающей рост биокристаллов. На основе анализа литературных данных формулируются задачки исследования.

^ Во 2-ой главе диссертации проводится исследование процесса обоюдной диффузии для Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов молекул белка и осадителя в критериях реальных тестов по выращиванию кристаллов белков на примере модельного протеина лизоцима. Моделировались конфигурации во времени концентраций соли, белка и пересыщения, результаты сравнивались с данными практических тестов, выполненных Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов по двум методикам: 1) диализа – камеры с смесями соли и белка разбиты мембраной, проницаемой для молекул соли и непроницаемой для молекул белка; 2) свободной диффузии – мембрана меж камерами с смесями соли и белка отсутствует Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов. Нестационарный перенос массы, количества движения и плотности в растворе описывался системой уравнений Навье-Стокса в безразмерной форме и приближении Буссинеска при неизменной температуре.

Приводятся результаты одномерного расчета динамики рассредотачивания пересыщения раствора Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов белка в кристаллизационной камере, демонстрирующие не плохое согласие приобретенных результатов с результатами практических тестов. Наибольшее различие в количественных значениях относительных пересыщений составляет ~4%.

Отмечается, что описанная модель позволяет в первом приближении решать главные Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов задачки моделирования процесса диффузионного массопереноса при росте биокристаллов в земных и галлактических критериях. Но изучить особенности процессов тепло- и массопереноса для кристаллизационных смесей в земных и галлактических критериях требуется с Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов учетом воздействия на их конвективных и вибрационных воздействий.

^ 3-я глава диссертации посвящена исследованию воздействия конвективных процессов на процесс кристаллизации для варианта нестационарного режима ТМП. Решается задачка определения нрава (структуры и скоростей) конвективных потоков в зависимости Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов от интенсивностей термогравитационной и термокапиллярной (Марангони) конвекций при выращивании кристаллов биоматериалов в земных и космических критериях на примере модельного белка лизоцима.

Учитывалось, что конвекция Марангони является отрицательным фактором при кристаллизации способом диффузии Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов паров, так как в этом способе находится свободная поверхность (жидкость-газ). Также и в методе жидкостной диффузии может быть присутствие открытой поверхности раствора.

Одним из главных причин, влияющих на Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов процесс кристаллизации, является стабильность поддержания температуры кристаллизационного процесса, которая на практике, обычно, не превосходит ±1°C.

Для описания процессов, происходящих в смесях при выращивании кристаллов биоматериалов, использовалась математическая модель на базе системы уравнений Навье Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов-Стокса в приближении Буссинеска. Расчетная область имела цилиндрическую форму с осью симметрии на левой ее границе. Расчет проводился для экспериментально применяемой концентрации белка лизоцима в аква растворе – 50 мг/мл. Перепад температур задавался на Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов верхней границе расчетной области.

Проведенные расчеты проявили, что при отсутствии конвекции Марангони в земных критериях реализуется режим термогравитационной конвекции, конкурирующей с диффузионным массопереносом (рис. 1). При всем этом конвективные потоки развиваются до Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов половины кристаллизационного объема по высоте. Скорость конвективных потоков в высшей части составляет
~10–5 мм/с. Эти расчеты подтверждают принятое представление о доминировании конвекционного переноса над диффузионным при единичной гравитации. В галлактических же Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов критериях, как демонстрируют расчеты, термогравитационная конвекция существенно ослабляется – скорость конвективных потоков миниатюризируется до ~10–9 мм/с (рис. 2). Диффузионный массоперенос в таких критериях является преобладающим.


(
z, мм

z, мм

z, мм

z, мм
а) (б) (а) (б)


r, мм

r, мм

r, мм

r Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, мм


I. Mn = 0; , мм/с II. Mn ≠ 0;, мм/с


Рис. 1. Структура (а) и изолинии (б) скорости конвективных потоков в растворе белка при наличии (II) и отсутствии (I) конвекции Марангони в земных критериях Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, ΔT = 1°C


(а) (б) (а) (б)
z, мм

z, мм

z, мм

z, мм



r, мм

r, мм

r, мм

r, мм


I. Mn = 0; , мм/с II. Mn ≠ 0; , мм/с


Рис. 2. Структура (а) и изолинии (б) скорости конвективных потоков в растворе белка при Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов наличии (II) и отсутствии (I) конвекции Марангони в космических критериях, ΔT = 1°C

Совершенно другая картина наблюдается при наличии конвекции Марангони. В данном случае даже при маленьком перепаде температур на открытой поверхности раствора значимым Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов образом изменяются структура и интенсивность конвективных течений: для значения ΔT = 1°C скорость конвективных потоков значительно растет и составляет ~1 мм/с как для земных, так и для галлактических критерий, но снижаясь до ~10–1 мм Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов/с только при снижении перепада температуры до ΔT = 0,1°C. В этих случаях поблизости свободной поверхности раствора наблюдается доминирование конвективного массопереноса.

Для обширно используемого способа лежачей капли проведенные расчеты проявили, что при наличии перепада Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов температур (который всегда вероятен в этом способе, что вызывает конвекцию Марангони) как для земных, так и для галлактических критерий реализуется режим преобладания конвекции Марангони. Конвективные потоки развиваются по высоте всей Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов капли, придавая кристаллизационному раствору вращательное движение и приводя тем к нарушению диффузионного режима массопереноса. Для обыденных значений ΔT = 1°C их скорость имеет порядок ~1 мм/с и не находится в зависимости от размера капли. При Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов снижении перепада температуры до ΔT = 0,1°C скорость понижается до ~10–1 мм/с, т.е. имеет пропорциональную зависимость от градиента температур, как и для варианта большого раствора. Проведенные расчеты демонстрируют, что для способа лежачей Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов капли конвективный массоперенос в объеме раствора всегда будет преобладать над диффузионным.

Проведенные теоретические расчеты проявили существенное воздействие непостоянностей температуры и возникающей конвекции Марангони на процессы ТМП при выращивании биоматериалов как в Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов земных, так и в космических критериях. При всем этом показано, что предпосылкой их появления является наличие температурного градиента на свободной поверхности раствора. Приобретенные результаты обосновывают необходимость заслуги высочайшей стабильности термических критерий при выращивании Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов кристаллов биоматериалов.

^ 4-ая глава диссертации посвящена исследованиям воздействия вибраций на процесс кристаллизации белков, потому что энерго воздействия значительно оказывают влияние на стабильность процесса кристаллизации. При всем этом исследования воздействия вибрационных воздействий Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов на процесс кристаллизации биоматериалов основаны на подготовительных расчетно-экспериментальных исследовательских работах воздействия вибрационных воздействий на рост неорганических кристаллов. Установлено, что при выращивании кристаллов полупроводников (на примере Ge, легированного Ga) поступательные колебания, осуществляемые повдоль Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов градиента температуры (по нормали к фронту кристаллизации), в широком спектре частот (0,5 ÷ 200 Гц) и амплитуд микроускорений (до 2·10–1 g0) не оказывают воздействия на процессы тепломассопереноса в расплаве и, соответственно, на однородность рассредотачивания легирующей примеси Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов в кристалле, что согласуется с проведенными теоретическими расчётами. Но к существенным нарушениям в рассредотачивании примеси приводят торсионные колебания (осуществляемые вокруг оси выращиваемого кристалла) при наличии свободной поверхности расплава.

При Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов открытой поверхности расплава (присутствие конвекции Марангони) к образованию в кристаллах микронеоднородности (полосчатости) приводят в области частот (0,5 ÷ 200 Гц) колебания с уровнем амплитуд
> 10–2g0. При амплитудах < 5·10–3g0 в выращенных кристаллах полосы роста отсутствуют. Разумеется Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, что появление полос роста связано с тем, что при достижении критичного уровня вибраций в непосредственной близи от фронта кристаллизации появляются сдвиговые смещения расплава, которые изменяют стационарный нрав конвективных течений.

Воздействие вибраций на процесс Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов кристаллизации биоматериалов изучен для 2-ух случаев вибрационных воздействий, соответствующих для критерий роста белков в космосе на Интернациональной галлактической станции (МКС) (g/g0 > 10–6): вибрационные возмущения, перпендикулярные градиентам концентрации белка и соли, и параллельные к градиентам Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов концентрации.

Расчеты для земных критерий проявили, что если опыт проводить в гелевой среде, то вибрации не оказывают воздействия на нрав массопереноса в растворе, и процесс идет в режиме диффузионного массопереноса.

В Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов критериях же микрогравитации действуют повторяющиеся, высокочастотные возмущения (10–6 < g/g0 < 10–2; 0,1 – 300 Гц по данным цитируемой работы), фактически определенные при реализации тестов по кристаллизации модельного белка лизоцима на МКС.

Расчеты для первого варианта проявили, что при Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов кристаллизации из-за образования градиентов концентрации соли и белка в белковой камере при вибрационных возмущениях, перпендикулярных градиентам концентрации, появляются конвекционные участки. Для второго варианта установлено, что при вибрационных возмущениях, параллельных градиентам концентрации Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, появление таких участков строго ограничено зонами, в каких происходит зародышеобразование либо осаждение образовавшихся кристаллов. Область, подверженная конвекции при наличии таких вибрационных возмущений, перемещается с фронтом зародышеобразования, тогда как в оставшейся части Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов белковой камеры конвекции нет, потому в ней следует ждать улучшения свойства кристаллов.

В обоих случаях (при росте неорганических и органических кристаллов) установлено существенное воздействие вибрационных воздействий на процессы массопереноса и, соответственно, совершенство Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов получаемых кристаллов в определенном спектре частот и амплитуд микроускорений. Но при всем этом воздействие вибрационных воздействий на процесс кристаллизации биоматериалов носит более непростой нрав.

^ В пятой главе диссертации изучена возможность и показано преимущество Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов использования температуры как средства регулирования кристаллизацией белков и представлен разработанный способ управления процессом кристаллизации. Показано, что в качестве регулирующих характеристик могут употребляться концентрация и различные типы осадителей, внесение либо изначальное Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов присутствие нейтральных добавок (буферы, гели, масла), затравливание (в т.ч. материалами с особенными качествами), наложение электронных и магнитных полей. Но для практической реализации управляемого выкармливания биокристаллов нужно было избрать применимый для физического Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов моделирования параметр. Изучена возможность раздельного управления кристаллизацией белка в капилляре с помощью температуры: отвод тепла в одной точке раствора () с термостатированием всего объема () (рис. 3).



T2

T1

^ Рис. 3. Схематическое изображение кристаллизационной ячейки с Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов капилляром

В этом способе становится вероятным поделить зародышеобразование и непосредственно рост методом увеличения пересыщения ( –концентрация белка) в определенном месте капилляра для стимулирования зародышеобразования () и, после образования единичных центров кристаллизации, снижения пересыщения в этом месте Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов до рационального для роста ().

Для описания температурно-управляемого процесса кристаллизации белка была разработана математическая модель, включающая в себя уравнения неразрывности, количества движения и переноса концентрации белка, решаемые в естественных Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов переменных. Для описания встраивания белковых молекул в кристалл потребовалась специфичная постановка граничных критерий – сток массы белка, вызываемый только конфигурацией . Отметим, что воздействие осуществляется через зависимость кривой растворимости на левой границе, зародышеобразование на которой более Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов возможно.

Система уравнений имеет последующий вид:

, (1)

где – плотность раствора, – скорость, – время, – координата,
– давление, – динамическая вязкость белка, – концентрация белка, – плотность белка, – коэффициент диффузии белка.

Граничные условия. При ставятся последующие условия:

для Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов скорости (2)

если , то , по другому ; (3)

; (4)

где – скорость вывода массы белка в кристалл, – плотность воды; – плотность белка, соответственная насыщению при данной температуре; – температура на левом конце, значение может поддерживаться либо изменяться по линейному закону Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов. При и ; .

В расчетах использовались реальные размеры капилляра: 30 мм,  1,5 мм (в таких капиллярах проводился процесс кристаллизации). В связи с наличием преобладающего размера () подверглась рассмотрению одномерная модель гидродинамики.

Исходные условия. При концентрация Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов белка в растворе 50 мг/мл, . Применяемая для вычислений зависимость растворимости модельного белка лизоцима от показана на рис. 4.



S, мг/мл
T, °C


Рис. 4. График аппроксимированной зависимости растворимости лизоцима, использованный для вычислений


Проводились расчеты процессов ТМП при Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов кристаллизации белка лизоцима с наложением градиента температуры на ячейку капиллярного типа (рис. 3). За ранее способом математического моделирования процессов ТМП было установлено, что при таких температурных критериях термическая конвекция в капилляре отсутствует.


t, час Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов
, мг·10–2

, °С

, °С

σ


а

t, час
, °С

, мг·10–2

σ


б

t, час
, °С

, °С

, мг·10–2

σ


в

Рис. 5. Временные зависимости выведенной в кристалл массы белка (, мг, ) и создаваемого при всем этом в растворе пересыщения (, ) от значений температуры в точке отвода Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов тепла (, °С, ) и в объеме (, °С, )

t, час
а

в

б

σ

Рис. 6. Временные зависимости создаваемого в растворе пересыщения :
пунктирная линия (а) – неуправляемый опыт с разностью температур;
точечная линия (б) – опыт без разности температур;
сплошная линия Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов (в) – опыт с управлением температурой


Расчетная область обрисовывает только водянистую фазу, процесс кристаллизации характеризуется значением пересыщения на границе и количеством выведенной в кристалл массы белка. Сетка из 60 точек, равномерная. Шаг по времени 1 с.

В Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов итоге проведенных расчетов были получены временные зависимости выведенной в кристалл массы белка и создаваемого при всем этом в растворе пересыщения (для характеризации процесса кристаллизации). Меняющимся параметром в расчетах являлась температура в точке отвода Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов тепла при стабилизации температуры объема раствора . В первом случае она поддерживалась неизменной и достаточной для зародышеобразования и кристаллизации, вызываемой разностью температур ( 19°С), во 2-м – равной температуре объема раствора, что недостаточно Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов для зародышеобразования и кристаллизации ( 32°С), в 3-ем же – изменялась по линейному закону со скоростью 1,5°С/час (0,025°С/мин), начиная с расчетного момента зародышеобразования (). Отметим, что т.к. требуется понижение пересыщения до , нужно Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов увеличение растворимости, и, соответственно, температуры.

На рис. 5 представлены результаты расчетов для 3-х разных типов тестов, а рис. 6 резюмирует расчетные значения пересыщения для этих случаев. Проведенные расчеты демонстрируют, что в первом случае (рис Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов. 5а), (рис. 6а) кристаллизация имеет место, но пересыщение растет до , что является лишним и будет приводить к массовому зародышеобразованию. Во 2-м случае (рис. 5б), (рис. 6б) пересыщение не достигает значения , и зародышеобразования не Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов происходит. В третьем же случае (рис. 5в), (рис. 6в) управление температурой по заданному закону на определенном шаге, после образования единичных эмбрионов, позволяет предупредить предстоящее возрастание пересыщения и плавненько снизить его до значения , нужного Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов для роста образовавшихся эмбрионов. При всем этом показано, что расчетное значение выведенной в кристалл массы белка  0,18 мг соответствовало размерам (0,8 мм  0,9 мм  0,5 мм) образовавшегося в реальных опытах кристалла лизоцима. При таком варианте Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов проведения опыта (с введением термического управления) следует ждать улучшения совершенства образующегося кристалла.

Приобретенные результаты на теоретическом уровне обосновали возможность управления при помощи температуры процессом кристаллизации биоматериалов в земных и, соответственно, в Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов галлактических критериях при создании локального градиента температуры в растворе. На их базе была поставлена и реализована задачка сотворения кристаллизационной ячейки для выкармливания в капиллярах кристаллов биоматериалов при помощи управления температурой.

^ В 6-ой главе Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов диссертации представлены результаты разработки способа и кристаллизационной аппаратуры для выкармливания высокосовершенных кристаллов биоматериалов. Рассматривается методика получения биокристаллов с управляемым процессом кристаллизации. Приводятся результаты тестов по кристаллизации модельного белка лизоцима.

Описывается конструкция экспериментальной Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов аппаратуры, которая применяется для температурного управления процессом кристаллизации. Она способна поддерживать и управлять температурой в границах 4÷40°C с точностью ±0,1°C. Запечатанный капилляр, содержащий кристаллизационный раствор, находится в одной части термостатированного корпуса Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, а в другой части размещается управляющая электроника. Капилляр в определенном месте контактирует с термоуправляемым конусом, создающим перепад температуры в данной точке. Управляющими параметрами в процессе кристаллизации являются две температуры: всего корпуса-термостата Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов и конуса, которые могут быть установлены в данных границах с шагом 0,1°C. При практических опытах корпус работает как термостат, поддерживая температуру в капилляре с общим объемом раствора 10÷20 мкл с точностью ±0,1°C, а Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов конус исполняет роль источника либо стока тепла зависимо от режима работы. Процесс зародышеобразования и кристаллизации наблюдается через микроскоп, для чего объем раствора подсвечивается светодиодом. Это позволяет на определенном шаге найти возникновение единичных эмбрионов поблизости Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов точки контакта и вовремя начать изменение температуры конуса (и, соответственно, пересыщения в растворе), предотвращая предстоящее общее зародышеобразование.

Лизоцим из белка куриных яиц (производитель Sigma) кристаллизовался из аква раствора (концентрация Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов 50 мг/мл) с использованием в качестве осадителя соли NaCl (концентрация 8%, pH = 4,6). Для оптимизации тестов по кристаллизации использовалась популярная зависимость растворимости белка от температуры.

На рис. 7 показаны кристаллы лизоцима, выращенные в капилляре без Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов управления температурой, т.е. обыденным способом свободной диффузии. Начальные водные смеси содержали 50 мг/мл белка и 8 % соли NaCl при pH = 4,6 соответственно. Длительность процесса кристаллизации – 1 сутки; в итоге опыта было получено огромное число кристаллов малого размера Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов (0,1–0,2 мм) и низкого свойства, при всем этом температура корпуса была неизменной и равной 20°C, с точностью поддержания ±0,1°C.

На рис. 8 показаны кристаллы лизоцима, выращенные в разработанной экспериментальной аппаратуре с применением термического управления Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов. Капилляр с кристаллами белка сфотографирован через микроскоп. Состав начального раствора и капилляр те же. Длительность процесса до появления кристаллических эмбрионов – 1 сутки; роста образовавшихся кристаллов – 5 суток. Получено три кристалла огромного размера Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов
(0,6–0,8 мм). Температура корпуса устанавливалась равной 32°C, с точностью поддержания ±0,1°C, температура конуса сначала опыта составляла 7°C и увеличивалась до 19°C после обнаружения эмбрионов.



1 мм

Рис. 7. Фото кристаллов лизоцима, выращенных без управления
температурой способом Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов свободной диффузии



1 мм

Рис. 8. Фото кристаллов лизоцима, выращенных в капилляре с применением способа управления температурой


Приводятся результаты рентгеновского исследования выращенных кристаллов. Снятые 75 рентгенограмм позволили собрать набор с полнотой 97,8% в интервале углов дифракции, позволяющих получение Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов разрешения до 1,5 Å. Исследованный кристалл лизоцима принадлежал к пространственной группе P4 с параметрами простой ячейки:  79,131 Å,  79,131 Å,  37,992 Å; мозаичность кристалла 0,204; средний R-фактор по эквивалентным отражениям – 5,63% в зоне разрешения до 1,6 Å.

Приобретенные свойства набора интенсивностей указали на высокое, с современных Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов позиций, качество выращенного кристалла, которое превосходит качество кристаллов, обычно выращиваемых в наземных изотермических опытах.

Приобретенные результаты позволяют прийти к выводу, что управление температурой дает возможность не только лишь управлять процессом на Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов шагах зародышеобразования и предстоящей кристаллизации, да и сделать рациональные условия для выкармливания качественных кристаллов белков.

^ В 3-х приложениях приводятся материалы, иллюстрирующие программную реализацию главных качеств диссертационной работы (метод расчета обоюдной диффузии белка и Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов осадителя в практических кристаллизационных опытах; метод расчета процесса кристаллизации лизоцима с управлением температурой, реализованный в математическом пакете Matlab на интегрированном языке программирования; метод обмена данными и командами меж управляющим Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов компьютером и разработанной кристаллизационной аппаратурой, реализованный в среде разработки Delphi).


^ Главные РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности процессов тепломассопереноса при росте в капиллярах кристаллов биоматериалов, в том числе при действии возмущающих воздействий (конвективных и вибрационных), определяющие условия Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов доминирования диффузионного массопереноса.

2. Разработана и программно реализована математическая модель, описывающая процесс зарождения и роста кристаллов белка из раствора. Математическая модель обрисовывает образование эмбрионов кристаллов и их рост зависимо от Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов локального значения перенасыщения.

3. При помощи предложенной модели определены рациональные условия (на примере выкармливания кристаллов лизоцима из аква раствора) кристаллизации белков размером более 100 мкм: стабильность поддержания температуры должна быть не ужаснее ±0,1°C; локальный градиент температуры – менее Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов 1°C/см. Сделанная модель полностью адекватна моделируемому явлению и может быть применена для параметрических исследовательских работ и прогнозных расчетов процесса кристаллизации белков при переменных температурных полях.

4. На базе проведенных теоретических расчетов Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов изучена и показана возможность кристаллизации в капиллярах белков с высочайшим совершенством их структуры, недосягаемом при использовании обычно применяемых в текущее время способов кристаллизации, заключающаяся в реализации способа управляемой кристаллизации белков Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, обеспечивающего раздельное управление процессом роста кристаллов как на шаге их зародышеобразования, так и в процессе кристаллизации.

5. Показано, что управление процессом зарождения и роста может осуществляться методом: а) задания и прецизионного поддержания требуемой температуры всего Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов раствора белка в капилляре; б) поддержания в локальной точке капилляра с веществом соответственной температуры для обеспечения нужного пересыщения для зарождения единичных (1–2) центров кристаллизации; в) конфигурации температуры в локальной точке капилляра Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов и, соответственно, пересыщения в процессе разращивания кристалла.

6. Разработан опытнейший лабораторный эталон экспериментального блока-кристаллизатора биокристаллов. В этой системе осуществляется не только управление температурой раствора с точностью регулирования ±0,1°C, да и реализована возможность сотворения пересыщения белка Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов в соответствующем месте капилляра за счет точечного подвода либо отвода в этом месте тепла (т.е. сотворения в этом месте локального температурного градиента), что исключает возможность образования огромного количества эмбрионов Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов по всему объему раствора, находящегося в контролируемых изотермических критериях, что исключает и многоцентровую спонтанную кристаллизацию.


^ ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В Последующих РАБОТАХ

1. Математическое моделирование и оптимизация роста биокристаллов / И.Ж. Безбах, В.Г. Косушкин Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, В.И. Стрелов и др. // Прогрессивные технологии, конструкции и системы в приборо- и машиностроении: Материалы Всероссийской научно-технической конференции. – М., 2004. – Т.1. – С.277–278.

2. Numerical models for biocrystal growing / V.P. Ginkin, B.G. Zakharov Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, I.Zh. Bezbakh et al. // Abstracts of the 14th International Conference on Crystal Growth. – Grenoble (France), 2004. – P.335.

3. Управление процессами кристаллизации биоматериалов в земных и галлактических критериях / И.Ж. Безбах, Б.Г. Захаров Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, В.И. Стрелов и др. // Тезисы докладов XI Государственной конференции по росту кристаллов. – М., 2004. – С.355.

4. Математическое моделирование и экспериментальные исследования воздействия вибраций и конвекции Марангони на микрооднородность кристаллов полупроводников Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов / В.И. Стрелов, Б.Г. Захаров, И.Ж. Безбах и др. // Поверхность. – 2005. – №10. – С.80–87.

5. Моделирование процесса управления ростом кристаллов белков в земных и космических критериях / И.Ж. Безбах, В.И. Стрелов, В.Г. Косушкин и Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов др. // Рост монокристаллов и тепломассоперенос: Труды
6-й интернациональной конференции. – Обнинск, 2005. – Т.3. – С.545–551.

6. Математическое моделирование и экспериментальные исследования воздействия температурных градиентов на процессы кристаллизации для земных и космических критерий / В.И. Стрелов Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, Б.Г. Захаров, И.Ж. Безбах и др. // Кристаллография. – 2005. – Т.50, №3. – С.536–544.

7. Mathematical modeling and experimental investigation of the effect of temperature gradients on crystallization processes under terrestrial and space conditions / V.I. Strelov Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов, B.G. Zakharov, I.Zh. Bezbakh et al. // Crystallography Reports. – 2005. – V.50, No.3. – P.490–498.

8. Прецизионное температурное управление процессом кристаллизации биоматериалов / И.Ж. Безбах, В.И. Стрелов, Н.И. Сосфенов и др. // Тезисы докладов Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов XII Государственной конференции по росту кристаллов. – М., 2006. – С.330.

9. Оптимизация роста кристаллов белков с применением способа термического управления / И.Ж. Безбах, В.Г. Косушкин, В.И. Стрелов и др. // Способы исследования и проектирования сложных Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов технических систем: Сборник статей (Труды МГТУ №592). – М., 2006. – С.18–26.

10. Кристаллизация белка лизоцима в прецизионно-управляемом градиенте температуры / В.И. Стрелов, Б.Г. Захаров, И.Ж. Безбах и др. // Кристаллография. – 2007. – Т.52, №6. – С.1134–1139.

11. Безбах Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов И.Ж., Стрелов В.И., Захаров Б.Г. Управление процессом зародышеобразования и роста биокристаллов // Тезисы докладов Русского симпозиума "Галлактическое материаловедение". – Калуга, 2007. – С.38.

12. Моделирование роста биокристаллов под воздействием управляющего термического поля / В Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов.П. Гинкин, И.Ж. Безбах, В.И. Стрелов и др. // Тезисы докладов Русского симпозиума "Галлактическое материаловедение". – Калуга, 2007. – С.43.

Безбах Илья Жанович


Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов


Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук


Подписано в Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов печать 25.09.2007.

Бумага офсетная 80 г/м2. Формат 60x84 1/16.

Усл. печ. л. 1. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ № 176.


Отпечатано в Редакционно-издательском отделе

КФ МГТУ им. Н.Э. Баумана

2
48000, г. Калуга, ул. Баженова, 2, тел Оптимизация процессов кристаллизации биоматериалов. 57-31-87



optika-i-kvantovaya-fizika.html
optiko-mehanicheskaya-mish.html
optimal-eccentrics-l-simmons.html